沙眼衣原體( Chlamydia trachomatis，Ct）是目前常見的生殖道感染性病原體之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）預(yù)計(jì)，每年新增Ct感染人數(shù)達(dá)1.3億。Ct感染后有50-70%的患者無明顯臨床癥狀，女性則70-80%。然而，無論癥狀性感染和無癥狀感染均會(huì)導(dǎo)致后遺癥，主要影響女性生殖系統(tǒng)，可能出現(xiàn)盆腔炎、異位妊娠和輸卵管不孕。此外，Ct與人乳頭瘤病毒和HIV的感染有關(guān)。由于Ct目前仍缺乏有效疫苗，對(duì)Ct的防治主要依賴于早期篩查、早診斷和早治療，選擇高效的實(shí)驗(yàn)室檢測診斷方法對(duì)控制Ct感染具有重要的影響。

　　中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心于2007年制定了第一版《生殖道沙眼衣原體感染診斷指南》，2020年中心根據(jù)世界衛(wèi)生組織指南和最新的研究結(jié)果對(duì)該指南進(jìn)行了修訂，新版指南將核酸檢測作為生殖道沙眼衣原體感染檢測的主要方法。

　　沙眼衣原體實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段：第一階段是沙眼衣原體細(xì)胞培養(yǎng)，即通過細(xì)胞培養(yǎng)來證明衣原體包涵體的存在；第二階段是非培養(yǎng)階段，相繼建立了酶免疫方法（EIA）、直接免疫熒光法（DFA）和免疫層析法（ICT），直接檢測樣本中的沙眼衣原體抗原；第三階段是核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAATs）階段，如熒光PCR、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等。下文則逐個(gè)展開簡要介紹。

　　各樣本采集方式

1. 　　尿液采集：采集清晨首次尿液或至少禁尿1h后的尿液，用無菌、無防腐劑的塑料器皿收集10-20mL前段尿液。
2. 　　尿道拭子：男性取材前1h內(nèi)不排尿，采用男性拭子插入尿道內(nèi)2-3cm，以旋轉(zhuǎn)方式輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)并保留5-10s后取出。女性可用手指自恥骨聯(lián)合后沿女性尿道走向輕輕按摩尿道，用同男性相似的方法取材。
3. 　　宮頸拭子：采樣時(shí)先用生理鹽水濕潤的擴(kuò)陰器擴(kuò)陰，無菌棉拭子清除宮頸口外面的分泌物，再將女性取材拭子插入宮頸管內(nèi)1-2cm，稍用力轉(zhuǎn)動(dòng)，保留5-10s后取出。細(xì)胞刷采樣：無菌棉拭子清潔宮頸口外表面，然后將細(xì)胞刷插入宮頸管內(nèi)1-1.5cm，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈，停留數(shù)秒后取出。孕婦不應(yīng)選擇細(xì)胞刷采樣方法。
4. 　　肛拭子：將取材拭子插入肛管2-3cm，接觸側(cè)壁10s，從緊靠肛環(huán)邊的隱窩中采集分泌物。被糞便嚴(yán)重污染的拭子必須丟棄，更換拭子后重新取材。
5. 　　口咽拭子：用壓舌板固定舌頭，拭子越過舌根到咽后壁及扁桃體隱窩、側(cè)壁等處，反復(fù)擦拭3-5次采集分泌物。
6. 　　陰道拭子：對(duì)青春期前女孩，將取材拭子放置于陰道后穹窿10-15s，采集陰道分泌物。對(duì)于處女膜完整的幼女需采用男性拭子，可通過處女膜孔采集陰道樣本。
7. 　　常規(guī)陰道拭子采集可用溫鹽水濕潤陰道窺器，輕輕按壓子宮，打開窺器，使用試劑盒推薦的采樣拭子放置于陰道后穹窿10-15s，采集陰道分泌物。
8. 　　眼結(jié)膜拭子：翻開下眼瞼，從眼角向中間輕輕用拭子擦拭下眼結(jié)膜表面采集分泌物。

　　細(xì)胞培養(yǎng)

　　一、檢測原理：

　　沙眼衣原體自身不能產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP），需依賴于宿主細(xì)胞提供。某些腫瘤細(xì)胞系可作為沙眼衣原體的易感細(xì)胞，經(jīng)化學(xué)物質(zhì)處理和離心使衣原體吸附于易感細(xì)胞。在適宜的培養(yǎng)條件下，沙眼衣原體以EB（原體）的形式侵入宿主細(xì)胞，被細(xì)胞膜包裹形成包涵體。內(nèi)化的EB（始體）分化成代謝活躍、體積較大且有分裂能力的RB,RB以二分裂的方式增殖并發(fā)育為成熟的子代EB，包涵體逐漸脹大，48-72h后包涵體和宿主細(xì)胞破裂釋放出成熟的EB，再重新感染易感細(xì)胞。培養(yǎng)物經(jīng)染色后于顯微鏡下可見包涵體。

　　二、檢測準(zhǔn)備：

• 　　儀器設(shè)備：C02培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、低溫冰箱或液氮罐、離心機(jī)及水浴鍋等。
• 　　細(xì)胞株：常用的敏感細(xì)胞株有McCoy、HeLa229或BHK-21細(xì)胞等。
• 　　檢測試劑：胰酶-EDTA液、樣本運(yùn)輸培養(yǎng)基、衣原體生長培養(yǎng)基、衣原體分離培養(yǎng)基、碘染色液、姬姆薩染色液及衣原體熒光單克隆抗體試劑等。

　　三、樣本采集：

　　細(xì)胞培養(yǎng)支持多種樣本類型，包括男性尿道樣本、女性宮頸樣本、直腸樣本、口咽樣本、眼結(jié)膜等樣本。此外細(xì)胞培養(yǎng)還可利用鼻咽位樣本。采集樣本洗脫于運(yùn)送培養(yǎng)基中保存在普通冰箱（2-8℃）內(nèi)，24h內(nèi)接種，超過24h應(yīng)放置于低溫冰箱（-20℃）保存。

　　四、檢測流程：

　　1. 細(xì)胞復(fù)蘇

　　將凍存的細(xì)胞管放置于37℃水浴中速溶（1min內(nèi)），將已復(fù)溫融化的細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移至已含有10 mL RPMI1640培養(yǎng)液的15mL離心管中，1000×g，離心5min，棄去上清液，加入適量培養(yǎng)液混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×106/mL左右，37℃，5%C02環(huán)境下培養(yǎng)過夜。次日更換生長培養(yǎng)基觀察生長情況，及時(shí)傳代。

　　2. 單層細(xì)胞制備

　　根據(jù)試驗(yàn)的目的可以選用不同孔的培養(yǎng)板進(jìn)行試驗(yàn)，以下步驟以96孔培養(yǎng)板為例，其他孔培養(yǎng)板可參照表1的比例進(jìn)行調(diào)整。提前將已滅菌處理0.25cm的蓋玻片放入培養(yǎng)板孔內(nèi)，注意觀察蓋玻片是否平鋪于培養(yǎng)板孔中。加入適量的細(xì)胞及培養(yǎng)液，37℃、5%C02環(huán)境下培養(yǎng)48h，鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及密度，待形成均勻覆蓋孔底的單層細(xì)胞。

　　3. 樣本接種與感染細(xì)胞

　　將保存于冰箱的樣本放置于37℃水浴中速融。在已接種細(xì)胞的培養(yǎng)板孔中加入適量樣本，每份樣本接種2孔。同時(shí)每板設(shè)有陽性和陰性對(duì)照孔。將接種后的培養(yǎng)板放置于22-35℃、3000×g條件下離心1h。去除樣本液，每孔加衣原體分離培養(yǎng)基0.1mL，放置于37℃、5%C02環(huán)境下培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。試驗(yàn)孔處理：第1孔（放入的蓋玻片上）進(jìn)行碘染色、姬姆薩染色或熒光單抗染色。如第1孔陰性，則第2孔進(jìn)行盲傳，如為陽性，則保存菌種。

　　4. 染色鑒定

　　沙眼衣原體培養(yǎng)后可以通過碘染色和姬姆薩染色進(jìn)行初步鑒定，通過直接免疫熒光法進(jìn)行確證。

• 　　碘染色：棄去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，每孔加入0.2mL甲醇，固定感染細(xì)胞10min，棄去甲醇后加碘染色液染5~10min。在玻片上滴加1μL碘甘油封片，取出蓋玻片，將細(xì)胞面朝下放在封固液上，顯微鏡下觀察結(jié)果。
• 　　姬姆薩染色：培養(yǎng)孔棄去培養(yǎng)液，每孔加入0.2mL甲醇，固定感染細(xì)胞10min，棄去甲醇后加姬姆薩染色液染30min，在玻片上滴加1μL碘甘油封片，取出蓋玻片，顯微鏡下觀察結(jié)果。
• 　　直接免疫熒光法：感染細(xì)胞用甲醇/丙酮固定10min，棄去甲醇后加熒光標(biāo)記單克隆抗體，37℃孵育30min，洗滌數(shù)次，取出蓋玻片放置于載玻片上，用堿性甘油封片后在熒光顯微鏡下檢查。

　　5. 結(jié)果判讀

　　沙眼衣原體培養(yǎng)陽性時(shí)，碘染色鏡檢可見細(xì)胞內(nèi)深棕色包涵體;姬姆薩染色可見細(xì)胞內(nèi)紫紅色包涵體;熒光單抗染色可見蘋果綠色熒光的包涵體和原體顆粒。 圖片

　　五、結(jié)果報(bào)告：

• 　　可見沙眼衣原體生長。
• 　　未見沙眼衣原體生長。

　　六、臨床意義：

　　臨床樣本中見沙眼衣原體生長可作為診斷生殖道沙眼衣原體感染的依據(jù)，但培養(yǎng)法靈敏度不高，因此臨床樣本未見沙眼衣原體生長時(shí)不能排除患者有生殖道沙眼衣原體感染。

　　七、注意事項(xiàng)：

• 　　棉拭子含有對(duì)衣原體生長有影響的物質(zhì)，取材后立即將樣本洗脫到運(yùn)輸培養(yǎng)基后，棄去拭子。
• 　　樣本取材后盡快接種，24h內(nèi)不能接種應(yīng)放置-70℃冰箱。
• 　　尿液、精液樣本及服過抗生素和使用陰道制劑的患者樣本不宜做衣原體培養(yǎng)。
• 　　單層細(xì)胞制備時(shí)如果細(xì)胞生長過密，包涵體染色過暗，側(cè)應(yīng)降低培養(yǎng)中的細(xì)胞濃度。
• 　　細(xì)胞生長稀疏、條束化，不能成片或被污染時(shí)，則應(yīng)重新復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞傳代次數(shù)超過5代不可進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
• 　　胎牛血清質(zhì)量對(duì)細(xì)胞生長影響很大，應(yīng)選擇質(zhì)量合格的血清。
• 　　放線菌酮的濃度對(duì)于衣原體生長影響較大，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況而定。

　　培養(yǎng)法曾經(jīng)被認(rèn)為是檢測沙眼衣原體感染的「金標(biāo)準(zhǔn)」方法。由于該法檢測敏感性較低（50-80%），且設(shè)備和操作技術(shù)要求高，樣本運(yùn)輸需低溫以保持沙眼衣原體的活性，試驗(yàn)周期長（需3-5d），樣本要求高，僅在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室開展，用于科學(xué)研究、抗菌藥物敏感性試驗(yàn)和方法學(xué)評(píng)價(jià)等。目前美國CDC在男童性侵和女童的生殖道外部感染的檢測中推薦使用該方法。

　　抗原檢測法

　　沙眼衣原體抗原檢測方法包括免疫層析法、直接免疫熒光法。

　　一、免疫層析法

　　1. 檢測原理：

　　樣本中衣原體脂多糖抗原與膠體金或乳膠標(biāo)記的衣原體單克隆抗體結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物通過毛細(xì)作用發(fā)生遷移，與固定有抗衣原體脂多糖的單克隆抗體結(jié)合顯色。

　　2. 檢測準(zhǔn)備：

　　相應(yīng)品牌的抗原檢測試劑盒。

　　3. 樣本采集：

　　該方法檢測的適宜樣本一般為宮頸樣本和尿道樣本。

　　4. 檢測流程：

　　按照相應(yīng)品牌的說明書操作即可，一般15-30分鐘出結(jié)果。

　　5. 臨床意義：

　　臨床樣本沙眼衣原體抗原檢測陽性可作為診斷生殖道沙眼衣原體感染的依據(jù)，但該方法的敏感性較低，陰性結(jié)果不排除患者感染沙眼衣原體。

　　二、直接免疫熒光法

　　1. 檢測原理：

　　熒光標(biāo)記的抗沙眼衣原體單克隆抗體與樣本中的沙眼衣原體結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光的衣原體原體或包涵體。

　　2. 檢測準(zhǔn)備：

• 　　儀器設(shè)備：熒光顯微鏡。
• 　　檢測試劑盒：包括熒光標(biāo)記抗沙眼衣原體單克隆抗體、已知沙眼衣原體陽性和陰性對(duì)照片、磷酸鹽緩沖液、堿性甘油封片劑。

　　3. 樣本采集：

　　該方法檢測的適宜樣本一般為宮頸樣本和尿道樣本。

　　4. 檢測流程：

• 　　樣本片制備：將采集的拭子樣本，均勻的涂布在玻片上，自然干燥后，滴加丙酮固定10min。
• 　　樣本、陰性和陽性對(duì)照片各滴加熒光標(biāo)記抗沙眼衣原體抗體。
• 　　放置于濕盒中，37℃孵育30min。
• 　　磷酸鹽緩沖液洗滌數(shù)次，每次10min，自然干燥。
• 　　滴加堿性甘油后加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
• 　　結(jié)果判讀：參照陰性、陽性對(duì)照片結(jié)果，觀察試驗(yàn)樣本。40x10倍鏡下發(fā)現(xiàn)10個(gè)及以上單一針尖樣綠色熒光的顆粒，判為陽性；每片可見小于10個(gè)單一針尖樣綠色熒光的顆粒，判為可疑；未發(fā)現(xiàn)典型發(fā)綠色熒光顆粒，僅可見復(fù)染紅棕色的細(xì)胞則為陰性。

　　5. 臨床意義：

　　臨床樣本沙眼衣原體抗原檢測陽性可作為診斷生殖道沙眼衣原體感染的依據(jù)，但該方法的敏感性較低，陰性結(jié)果不排除患者感染沙眼衣原體。

　　6. 注意事項(xiàng)：

• 　　樣本采集后立刻制備樣本片，制備涂片時(shí)拭子輕輕滾動(dòng)且要涂布均勻。
• 　　使用的玻片應(yīng)清潔，防止雜質(zhì)引起的假陽性染色。
• 　　涂片邊緣的濃集染色可能是由于熒光試劑干涸引起，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

　　直接免疫熒光法法適用于多種標(biāo)本，具有特異、快速的優(yōu)點(diǎn)，但由于判讀受主觀因素影響，且熒光標(biāo)記物不穩(wěn)定，不適宜標(biāo)本篩查。免疫層析法雖然敏感性較低，但因操作簡單，省時(shí)快捷，對(duì)場地和設(shè)備要求低，目前在我國臨床上仍被廣泛應(yīng)用。

　　核酸檢測法

　　沙眼衣原體的核酸檢測方法主要有實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、基因測序技術(shù)及基于核酸的POCT等。核酸檢測主要通過擴(kuò)增沙眼衣原體的7.5kb隱蔽性質(zhì)粒DNA、染色體DNA或23S rRNA、16S rRNA等靶基因來檢測病原體。目前最成熟的技術(shù)還是熒光PCR法。

　　由于全球新冠疫情的大流行，目前我國人群已經(jīng)對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的流程比較熟悉了，臨床進(jìn)行沙眼衣原體的流程主要也是樣本采集—核酸提取—上機(jī)擴(kuò)增—結(jié)果判讀，具體操作細(xì)節(jié)會(huì)根據(jù)各個(gè)廠家不同試劑以及儀器而有所不同，因此這里不再贅述。

　　目前所有美國FDA批準(zhǔn)的商品化核酸擴(kuò)增檢測產(chǎn)品均可適用于男性尿液和尿道拭子，女性宮頸分泌物、陰道分泌物及尿液，國內(nèi)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測日前適用的樣本主要為男性尿道拭子和女性宮頸拭子，尚不能應(yīng)用于無創(chuàng)性樣本（男性尿液、女性陰道拭子及女性尿液）的檢測。國內(nèi)外所有的核酸檢測試劑目前對(duì)生殖道外的樣本如直腸和咽部拭子均未被批準(zhǔn)應(yīng)用，因此建議在生殖道外部位檢測出陽性的樣本時(shí)，仍需要進(jìn)一步的試驗(yàn)排除假陽性。

　　Nelson等對(duì)使用不同女性標(biāo)本進(jìn)行NAATs檢測的準(zhǔn)確性進(jìn)行系統(tǒng)分析，得出陰道拭子( 臨床采集或自采) 以及宮頸拭子均優(yōu)于尿液檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度.見下圖：

　　對(duì)于男性人群，Chernesky等對(duì)男性尿道拭子和首段尿標(biāo)本用 NAATs 進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示無論有無癥狀，尿液即可達(dá)到檢測要求。 在主流的熒光PCR技術(shù)之外，基于核酸的POCT近年來也越來越受到關(guān)注?；诤怂岬腜OCT方法可在封閉系統(tǒng)中自動(dòng)進(jìn)行樣品制備、提取、擴(kuò)增和檢測，出具結(jié)果。目前也有一些品牌獲得不同國家的認(rèn)證，但是相關(guān)體系未來的普及性應(yīng)用需要繼續(xù)探索。

　　血清學(xué)檢測

　　血清學(xué)試驗(yàn)對(duì)泌尿生殖道沙眼衣原體檢測的敏感性和特異性不高，日前不推薦應(yīng)用于急性無并發(fā)癥的泌尿生殖道感染的診斷和篩查。在許多患者中，僅有侵入性沙眼衣原體才可以導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體水平達(dá)到可檢測的量，抗體水平可以保持許多年，且個(gè)體差異較大。近期，美國的研究團(tuán)隊(duì)正通過開發(fā)多抗原表位聯(lián)合的檢測手段，來提高血清學(xué)抗體檢測的靈敏度和特異性。整體而言，新型血清學(xué)抗體檢測方法仍處于探索階段。

　　總結(jié)

　　鑒于50%男性和70%女性感染沙眼衣原體后表現(xiàn)為無狀感染，建議對(duì)育齡期女性、性病門診就診者、有高危性行為的人群等進(jìn)行篩查。核酸擴(kuò)增技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)以及高通量的優(yōu)點(diǎn)，可用于生殖道沙眼衣原體感染的篩查與檢測 。 

沙眼衣原體檢測試劑

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